Psychoterapia warszawa
psychoterapeuta warszawa, psychoterapeuta Wrocław, psychoterapia, psychoterapia warszawa

Mutacje Somatic HIF2A w funkcjonowaniu w zespole łożyska z czerwienicą AD 4

Posted in Uncategorized  by admin
April 18th, 2018

Mutacje A530T i A530V w HIF2A wprowadzono do tego plazmidu za pomocą zestawu do mutagenez ukierunkowanych na błyskawicę (Agilent). Sekwencje DNA plazmidów weryfikowano przez sekwencjonowanie całego regionu kodującego HIF2A. Sekwencję kodującą ludzkiego genu VHL wstawiono do wektora wejściowego pCMV6 (OriGene). Uzyskaliśmy również plazmid HA-EGLN1 zawierający ludzki gen kodujący białko 2 zawierające domenę prolilową hydroksylazy (PHD2) .17 Test hydroksylacji
Oznaczenie hydroksylacji HIF-2. przeprowadzono jak opisano poprzednio.18 Hydroksylację peptydu analizowano za pomocą spektrometrii masowej z udziałem jonizacji metodą laserową desorpcji jonizacyjnej-czas przelotu (MALDI-TOF), jak opisano poprzednio.19
W celu wykrycia wiązania VHL po hydroksylowaniu HIF-2. zsyntetyzowano radioaktywnie wyznakowane białko VHL przy użyciu systemu TNT Quick Coupled Transcription / Translation System (Promega) w obecności [35S] -metioniny (PerkinElmer). Perełki poddane działaniu EGLN1 przemyto i inkubowano z [35S] -VHL przez 2 godziny w 4 ° C. Związany VHL eluowano przez ogrzewanie w buforze do próbek zawierającym dodecylosiarczan sodu i rozdzielono na żelu NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen).
Real-Time PCR
Całkowity RNA wyekstrahowano z próbek mikroskopijnego guza, a ekspresję RNA informacyjnego (mRNA) genów związanych z niedotlenieniem badano za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w systemie PCR ABI 7500 w czasie rzeczywistym. Zastosowane zestawy primerów to EDN1 (OriGene HP205717), EPO (OriGene HP200740), GLUT1 (OriGene HP209446), VEGFA (Qiagen QT01682072) i .-aktyna (Promega G5740).
Oznaczenie immunoprecypitacji chromatyny
Komórki 786-O z niedoborem VHL z komórek nerkowych transfekowano konstruktami HIF-2. przez 72 godziny. Oznaczenie immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) przeprowadzono za pomocą zestawu do sorpcji enzymatycznej SimpleChIP Plus (Cell Signaling Technology). Do immunoprecypitacji użyto znacznika anty-HA (OriGene). Wytrącony DNA analizowano za pomocą ilościowej amplifikacji PCR promotora transportera metalu dwuwartościowego (DMT1) zawierającego elementy odpowiedzi hipoksji (HRE), jak opisano wcześniej.
Wyniki
Zwiększenie ekspresji genów związanych z niedotlenieniem
Przeanalizowaliśmy szlaki kanoniczne związane z hipoksją, mierząc ekspresję genów w guzach od dwóch pacjentów. Jako kontrolę zastosowano normalną próbkę rdzenia nadnerczy. Stwierdziliśmy wyraźną regulację w górę genów poniżej HIF2, w tym EDN1, EPO, GLUT1 i VEGFA w próbkach nowotworowych od obu pacjentów (Figura 1B), co sugeruje, że kliniczna prezentacja czerwienicy była konsekwencją sygnalizacji związanej z niedotlenieniem.
Mutacyjna analiza
Aby określić gen odpowiedzialny za czerwienicę, zsekwencjonowaliśmy zarówno DNA linii zarodkowej z leukocytów, jak i DNA z guzów
[podobne: inhibitor korozji, Psycholog Wrocław, terapia manualna ]

Tags: , ,

Komantarze do artykulu sa obecnie zamkniete, popros administratora strony o ich otwarcie jesli chcesz wziasc udzial w dyskusji pod artykulem. Kontakt do administracji w zakladce kontakt.(Mozliwe jest rowniez przeslanie propozycji tematow ktore mozemy uwzglednic w nastepnych naszych artykulach, bedziemy wdzieczni za wasze cenne sugestie i postaramy sie je wykorzystac przy kolejnych wpisach.)

Powiązane tematy z artykułem: inhibitor korozji Psycholog Wrocław terapia manualna